Аргінілгліциласпарагінова кислота

Шаблон:Універсальна картка Аргінілгліциласпарагінова кислота (RGD-послідовність) — трипептид, який складається з L-аргініну, гліцину й L-аспарагінової кислоти.

Практично усі дизінтегрини містять RGD-послідовність, яка розпізнається рецептором GPIIb/IIIa у молекулі фібриногену й інших чинниках коагуляції. Тому пептиди або дрібні молекули, які містять ключову послідовність амінокислот Arg-Gly-Asp можуть бути потенційними інгібіторами взаємодії GPIIb/IIIa рецепторів тромбоцитів із фібриногеном.

Спектроскопія

Для розшифрування сполуки використовується два підходи. Перший — визначення числа індивідуальних амінокислотних залишків й їх ідентифікація, другий — секвенування.

Для ідентифікації трьох амінокислот використовується інформація з спектрів ядерного магнітного резонансу ${}^{\mathrm{1}}\mathrm{H},{}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{P}\mathrm{T},\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y},\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y},\mathrm{H}\mathrm{M}\mathrm{Q}\mathrm{C}.$ Пептиди є хіральними молекулами. Усі метиленові групи діастереотопні, навіть групи гліцину (метиленова група у вільному гліцині є енантіотропною). Починати аналіз пептидів потрібно зі спектру $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}.$ У двохвимірному варіанті $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ відображає кореляції між усіма спінами спінової системи, а кореляції зі спінами поза системою відсутні. У трипептиді три окремі спінові системи, і вони знаходяться у спектрі $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}.$Протон $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ із сигналом при 8,95 м.д. корелює із двома резонансами (3,96 та 4,13 м.д.), що виявляє спінову систему. Якщо екстраполювати цю інформацію на спектр $\mathrm{H}\mathrm{M}\mathrm{Q}\mathrm{C},$ то виявиться, що ці протонні резонанси корелюють із одним атомом вуглецю при 41,9 м.д. (тобто діастереотопною метиленовою групою). Ця амінокислота ідентифікується як залишок гліцину, а кореляція із протоном $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ амідної групи дозволяє зробити висновок, що залишок гліцину не є $\mathrm{N}$-кінцевим.

Інша спінова система стає очевидною, якщо почати із загальноприйнятого початку — сигналу при $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ 8,26 м.д. Є три кореляції з цим сигналом для усіх чотирьох фрагментів цієї спінової системи. Якщо знову перенести цю інформацію прямо у спектр $\mathrm{H}\mathrm{M}\mathrm{Q}\mathrm{C},$ можна знайти відповідні вуглецеві сигнали. Звичайно, кореляція із резонансом $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ відсутня. Сигнал протона при 4,41 м.д. корелює із резонансом атома вуглецю при 52,4, а спектр ${}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{P}\mathrm{T}$ підтверджує, що це сигнали 2,58 й 2,72 м.д., які корелюють із одним сигналом атома вуглецю при 38,6 м.д. Спектр ${}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{P}\mathrm{T}$ підтверджує, що це сигнал метиленової групи. Цей залишок ідентифікується як аспарагінова кислота, і знову можна зробити висновок, що це не $\mathrm{N}$-кінцевий залишок.

Аналіз останньої спінової системи починається з розгляду сигналу протона $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ при 7,35 м.д. Ця спінова система включає ще чотири протонних резонанси; спектр $\mathrm{H}\mathrm{M}\mathrm{Q}\mathrm{C}$ та спектри ${}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{P}\mathrm{T}$ вказують, що вони відповідають одній метиновій і трьом метиленовим групам. Таким чином, цей амінокислотний залишок є аргініном.

Спектр $\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ можна використовувати для верифікації отриманих результатів, хоча необхідності у цьому немає. Спектри $\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ та $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ не є надлишковими й взаємно доповнюють одне одного принаймні у одному важливому аспекті. Хоча спектр $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ відображає усі спіни у спіновій системі, він не відображає реальні спін-спінові взаємодії. Наприклад, оскільки протон $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ із сигналом при 8,26 м.д. (у залишку аспарагінової кислоти) відображає кореляцію лише із метиновою групою у спектрі $\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y}$, то можна із впевненістю сказати, що ця група $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ бере участь у пептидному зв'язуванні, а метинова група є α- або антисиметричним атомом вуглецю у амінокислотному залишку. Протон $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ із сигналом при 7,35 м.д., віднесений до залишу аргініну, корелює із усіма спінами у спектрі $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}$, але виявляє спін-спінову взаємодію лише із метиленовою групою при 2,24 м.д. у спектрі $\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y}$. Це спостереження дозволяє зробити два висновки. По-перше, протон $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ не взаємодіє із α-атомом вуглецю агрініну і тому повинен відноситися до $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ гуанідінової групи, а не α-аміногрупи. По-друге, аргініновий залишок повинен бути $\mathrm{N}$-термінальним, оскільки у спектрах $\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ та $\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y}$ немає кореляції між метиновим протоном та сигналом при 4,13 м.д. та протоном $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$.

Інтегральна інформація, отримана із спектрів ${}^{\mathrm{1}}\mathrm{H},{}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{P}\mathrm{T},\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{S}\mathrm{Y},\mathrm{T}\mathrm{O}\mathrm{C}\mathrm{S}\mathrm{Y},\mathrm{H}\mathrm{M}\mathrm{Q}\mathrm{C}$, дозволяє виконати віднесення сигналів усіх протонів у спектрі ${}^{\mathrm{1}}\mathrm{H}$ за винятком тих, які зазнають швидкого обміну (тобто протони карбоксильних груп й вільних аміногруп), та сигналів усіх не четвертинних атомів вуглецю у спектрі ${}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}$. Необхідності у віднесенні протонів, які швидко обмінюються, немає.

Що стосується секвенування, то потужними методами ядерного магнітного резонансу є $\mathrm{H}\mathrm{M}\mathrm{B}\mathrm{C},\mathrm{R}\mathrm{O}\mathrm{E}\mathrm{S}\mathrm{Y}\mathrm{(}\mathrm{N}\mathrm{O}\mathrm{E}\mathrm{S}\mathrm{Y}\mathrm{)}.$ Перший відображає дальні спін-спінові взаємодії ${}^{\mathrm{1}}\mathrm{H}\mathrm{-}{}^{\mathrm{1}\mathrm{3}}\mathrm{C}$ (через 2 зв'язки із ${}^{\mathrm{2}}{\mathrm{J}}_{\mathrm{C}\mathrm{H}}$). Для рішення задачі секвенування цей експеримент відображає кореляцію між сусідніми амінокислотами, оскільки «бачить» через амідний (пептидний) карбоніл амідний протон $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$. Це дозволяє провести віднесення карбонільних груп.

Інший зв'язок між амінокислотними залишками встановлюється при аналізі взаємодії між протоном $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ аспарагінової кислоти й двома протонами $\mathrm{H}\mathrm{-}\mathrm{2}$ гліцину, який виявляється посередництвом NOE. У цьому випадку немає перекривання сигналів. Цікаво відзначити кореляцію через NOE у залишку аспарагінової кислоти між протоном $\mathrm{N}\mathrm{-}\mathrm{H}$ та лише одним з двох діастереотопних метиленових протонів ($\mathrm{H}\mathrm{-}\mathrm{3}$). Ця селективна взаємодія вказує на заторможене обертання й дозволяє просторову диференціацію й віднесення сигналів двох діастереотопних протонів.